ESPERIMENTO DI TRASFORMAZIONE BATTERICA SU Escherichia coli

Questo procedimento, ampiamente usato nelle biotecnologie in ambito agrario, in medicina e in molti altri campi, consiste nell'acquisto da parte della cellula di un frammento di DNA. In seguito alla trasformazione l'organismo rende visibile l'informazione acquisita con una nuova caratteristica prima assente.

Possiamo trasformare il batterio Escherichia coli con un gene che codifica per la proteina verde fluorescente (Green Fluorescent Protein)  presente in natura nella medusa bioluminescente Aequorea victoria che è la sorgente di questo gene. In tal modo potremo distinguere alla fine dell'esperimento le colonie batteriche trasformate, che ai raggi UV mostreranno un particolare colore verde fluorescente.

La soluzione di trasformazione è una soluzione 50mM di CaCl₂. I cationi Ca²⁺ neutralizzano le cariche negative repulsive dei fosfati del DNA e dei fosfolipidi della membrana cellulare, permettendo così al DNA di attraversare la parete cellulare e di penetrare all'interno della cellula.

Inoltre si deve eseguire una procedura di shock termico per migliorare l'efficienza di uptake batterico. Infatti lo shock termico aumenta la permeabilità della membrana cellulare verso il DNA (50s a 42°C, trasferimento rapido in ghiaccio per 2 minuti e poi temperatura ambiente).  

Il plasmide pGLO è il frammento di DNA che viene introdotto nel batterio, è formato da 5400 paia di basi e contiene diverse informazioni genetiche inserite tramite gli enzimi di restrizione: ·     Il gene bla codifica per la beta-lattamasi che conferisce resistenza all'antibiotico ampicillina.  La beta-lattamasi prodotta viene secreta dalle cellule ed inattiva l'ampicillina presente nel terreno colturale. ·    ori: punto di origine della replicazione. Il plasmide, ad alto numero di copie, si replica autonomamente a partire dal punto di origine della replicazione. ·     GFP: gene che codifica la Green Fluorescent Protein ·     AraC: proteina regolatrice dell'operone arabinosio I terreni di coltura che permettono ai batteri di crescere contengono anche sostanze in grado di selezionare i batteri trasformati e di rendere evidente la trasformazione: ampicillina (amp)un antibiotico che blocca la crescita delle cellule, arabinosio (ara) uno zucchero che inattiva il repressore favorendo il legame con l'RNA polimerasi, con conseguente produzione della proteina GFP.